关于HPLC流动相，应该避免的10个坏习惯！

发布日期: 2017-04-25

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1. 在流动相中加入有机试剂后测量pH值

所谓的pH值，是基于水为溶剂的体系才叫pH值，所以正确的调节缓冲溶液pH值的做法是在水溶液中进行。如果你添加了有机溶剂后再测量pH值，这其实与添加之前测量的pH值会有所不同。

然而，最重要的一点是你的操作习惯要保持一致。如果你习惯是在添加有机溶剂之后测量pH值，那你只要确保每次的操作都是如此就可以了。虽然你这样操作不是100%的准确，但至少它与之前的做法是一致的。这对于一个完整的研究来说，相较之你在添加有机溶剂之前测量pH值而获得了一次准确的数据来说，保持一致的操作方法可能会更重要。

2. 不用缓冲试剂

使用缓冲试剂的目的是控制流动相的酸度，防止其pH值发生较大的变化。

有很多因素都可能会导致流动相pH值的改变，而最终影响色谱峰的保留时间、峰型及峰值响应，如样本基质、空气中的二氧化碳和流动相所使用的水源等因素。

3. 未在缓冲盐正确的pH值范围内使用

每种缓冲盐都仅可以在固定的两个pH值单位内提供其最佳的缓冲效果。在其缓冲窗外时，缓冲盐对于pH值的改变是无效的。

4. 向有机溶剂中加缓冲剂

水相缓冲盐直接添加到有机相存在很高的危险，因为其中的缓冲盐可能会发生沉淀——在许多情况下都会如此，并非偶尔才发生。而如果将有机溶剂添加到水相的缓冲溶液中，就会大大降低该风险。

5. 色谱洗脱梯度从0%开始

虽然，现代新型液相色谱泵对于流动相的混合和在线脱气都非常有效，然而并不是每一个沿用你的方法的人都拥有一个高质量的泵。比如，预将A相和B相按一定体积比混合而最终达到100%A相运行，那么应该从950mL水相和50mL有机相的混合开始，然后经过过滤和脱气的过程。这可以大大降低高效液相色谱的可变性，避免系统中产生气泡和沉淀物的的风险。

同时，对于液相色谱来说，值得我们注意的是：使用二元泵将A相和B相按体积比95:5混合后作流动相，与预先在试剂瓶中直接将A相和B相按相同体积比配制成的混合液作流动相（单元泵时），两者最终获得的色谱峰保留时间是不同的——如果你采用预先混合，通常需要增加有机溶剂在混合溶液中所占的百分比才能获得相同的保留时间。

6. 没用使用正确的酸或者碱来调节缓冲溶液的pH值

应该使用你的缓冲盐对应的酸或碱来调整溶液的pH值，例如磷酸钠缓冲溶液应选择用磷酸或氢氧化钠作调节剂。

7. 未给出方法中所用的缓冲溶液的完整信息，如5g磷酸钠溶于1000 mL水中

缓冲盐的类型（单元、双元或三元的）决定了它的pH缓冲范围。而溶液中溶质的物质的量浓度决定缓冲强度。5g无水磷酸钠与5g一水合磷酸钠两者具有不同的缓冲能力和对保留时间不同的影响力。

8. 操作前未检查管道的使用情况

如果前一个方法中，管道（如B相）运行的是缓冲溶液，而你现在的方法中B相为有机相，这很可能使你的泵管或者泵头发生缓冲盐沉淀。我早期也犯过同样的错误，造成了很大的损害。如果你也犯了同样的过错，你需要用水-有机试剂（体积比80:20）进行冲洗。

9. 将流动相试剂瓶中的流动相完全用光

你拥有足够的流动相来完成整个试验运行，与你的流动相恰好可以运行完最后几个样本的概率都是存在的。但是假使你的流动相准备的不够充足，除了存在一定的泵和色谱柱空运行的风险外，还会有其它的问题存在。如由于溶液中水会从试剂瓶的上方蒸发，所以试剂瓶顶部流动相的成分已经发生了改变。如果你使用了瓶中最后这部分试剂，事实上它们就是原来试剂瓶中顶部的那部分，当它们通过色谱柱时可能会有渣滓滞留在色谱柱中。

10. 使用超声给流动相脱气

超声法对于确保你所用的缓冲盐完全溶解很有效，但它不是最有效的脱气方法，而且由于超声时溶液会快速升温而导致流动相中有机试剂蒸发。为了节省时间，你可以花5 min时间通过真空过滤机来过滤流动相，这可以一步达到脱气和过滤的两个目的。