代餐食品可替代正常饮食,是一种治疗肥胖的有效策略^[1]。与其他治疗方法相比,代餐不仅能有效降低超重、肥胖患者的食欲,控制人体能量密度,还能防止控制饮食过程中必需营养素缺乏等情况,同时代餐食品依从性较好,有助于保持长期减重的效果,甚至改变食用者的饮食行为习惯^[2-5]。随着市场化规模的扩大,代餐食品生产质量上的隐患不断浮现。由于多数代餐食品是通过电商平台和微商平台销售,某些不良商家为达到快速瘦身的效果,在代餐食品中违规添加对人体有害的药物成分,如盐酸西布曲明、酚酞等^[6-7]。西布曲明、芬氟拉明等药物价格低廉,有一定的抑食减肥功效,但是可能对肝脏、肾脏等造成严重损害,甚至危及生命。相关文献资料^[8-9]显示,西布曲明在德国、美国、意大利等地已导致数十人死亡,被许多国家禁止使用。我国已将西布曲明列入《保健食品中可能非法添加的物资名单(第一批)》中,明确认定其为会严重损害肝脏、肾脏等器官组织的“有毒、有害的非食品原料”；国内《食品安全法》规定食品中不得添加药物成分；中国营养学会发布的团体标准T/CNSS 002—2019《代餐食品》规定代餐食品的生产条件应符合国家有关规定^[9],代餐食品中所使用的原料应符合相应的食品标准和规定,禁止使用非食品原料和禁用物质。

目前,缺乏代餐食品中非法添加药物的检测标准。若采用常规三重四极杆质谱法检测,则会对设备造成较大污染,影响同批次其他样品的检测,造成检测结果假阳性,需要对仪器进行长时间冲洗平衡操作才能满足正常检验要求,极大影响了仪器寿命和工作效率。三重四极杆复合线性离子阱质谱法属于混合型串联质谱法^[10-16],兼具传统四极杆和线性离子阱的双重功能,可以自由进行转换,不但保留了串联四极杆多反应监测模式的选择性及灵敏度优势,还具有线性离子阱增强子离子的扫描功能,且同批次检测时药物残留少,抗污染能力更强,能有效提高复杂基质中微量化合物的定性定量能力。本工作结合QuEChERS前处理方法,采用高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法测定代餐食品中6种非法添加减肥药物的含量。

1.   试验部分

1.1   仪器与试剂

Triple Quad™ 5500+型高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱仪；3K15型冷冻离心机；MS3型涡旋振荡器；Millipore Advantage 5型超纯水处理系统；AR223CN型电子天平。

单标准储备溶液：取各组分的对照品,用甲醇超声溶解和稀释,配制成1 000 mg·L⁻¹的单标准储备溶液,于−18 ℃储存。

混合标准中间液：取100 μL单标准储备溶液于同一10 mL容量瓶中,用甲醇稀释,配制成10.0 mg·L⁻¹的混合标准中间液,于−18 ℃储存。

混合标准溶液系列：取适量混合标准中间液,用甲醇逐级稀释,配制成0.5,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0 μg·L⁻¹的混合标准溶液系列。

盐酸西布曲明(CAS号84485-00-7)对照品的纯度为99.9%（使用时,以西布曲明计）；盐酸N-单去甲基西布曲明(CAS号84467-94-7)对照品的纯度为97.7%（使用时,以N-单去甲基西布曲明计）；盐酸N,N-双去甲基西布曲明(CAS号84484-78-6)对照品的纯度为97.0%（使用时,以N,N-双去甲基西布曲明计）；盐酸麻黄碱(CAS号50-98-6) 对照品的纯度为100.0%（使用时,以麻黄碱计）；芬氟拉明(CAS号404-82-0) 对照品的纯度为97.0%；酚酞(CAS号77-09-8)对照品的纯度为99.8%；甲醇、甲酸、乙酸铵为色谱纯；试验用水为一级水；试验样品为市售代餐饼干、代餐粥和代餐奶昔,打磨成粉（浆）后,装入洁净容器中,置于干燥器中保存。

1.2   仪器工作条件

1.2.1   色谱条件

ZORBAX Eclipse Plus C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱温35 ℃；流量0.30 mL·min⁻¹；流动相A为甲醇,B为含5 mmoL·L⁻¹乙酸铵的0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液。梯度洗脱程序：0~0.2 min,A为35%；0.2~1.0 min,A由35%升至65%,保持0.5 min；1.5~3.5 min,A由65%升至85%,保持1.0 min；4.5~4.6 min,A由85%跳转至35%,保持0.4 min。进样量1 μL。

1.2.2   质谱条件

电喷雾离子（ESI）源,正离子（ESI⁺）模式；离子源温度500 ℃；检测方式 多反应监测-信息依赖采集-增强子离子（MRM-IDA-EPI）扫描模式；气帘气压力207 kPa；碰撞气模式 中等；喷雾气压力379 kPa,辅助加热气压力379 kPa；离子化电压5 500 V。其他质谱参数见表1,“*”代表定量离子。

表  1  质谱参数

Table  1.  MS parameters

序号	化合物	保留时间/min	母离子质荷比 (m/z)	产物离子m/z	去簇电压/V	碰撞能量/eV
1	麻黄碱	1.41	166.1	148.2*,133.1	40	17,26
2	芬氟拉明	2.38	232.2	159.0*,109.0	117	25,50
3	酚酞	2.71	319.3	225.1*,197.1	93	28,41
4	西布曲明	3.30	280.1	125.0*,139.1	93	36,16
5	N-单去甲基西布曲明	3.46	266.3	125.0*,139.0	62	33,19
6	N,N-双去甲基西布曲明	3.61	252.2	125.0*,139.0	52	34,15

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1.3   试验方法

取样品1.00 g于15 mL塑料离心管中,加入8.00 mL甲醇,振荡2 min,涡旋提取5 min,用甲醇定容至10.00 mL,摇匀,以转速8 000 r·min⁻¹离心5 min。取6.00 mL上清液于净化管[含25 mg N-丙基乙二胺(PSA)、25 mg 十八烷基硅烷键合硅胶（C₁₈）和150 mg 硫酸镁（MgSO₄）]中,涡旋2 min,以转速8 000 r·min⁻¹离心5 min。分取适量上清液,过0.22 μm有机滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。若样品中待测组分含量较高时,用甲醇稀释至线性范围。

2.   结果与讨论

2.1   质谱条件的优化

以100 μg·L⁻¹单标准溶液为待测对象,通过进样针直接连通质谱（MS only）模式优化质谱条件。利用SCIEX Triple Quad软件的化合物开发功能进行MRM-IDA-EPI质谱扫描。设定MRM检测窗口时间并进行分段时间扫描,以满足色谱峰采集点数；然后进行IDA扫描,继而触发EPI扫描,富集碎片离子,从而获得高灵敏的全谱信息。先利用一级质谱扫描筛选母离子,ESI⁺模式下得到了[M+H]⁺；然后进行二级质谱扫描,选择响应较高的碎片离子为定量离子,次强的碎片离子为定性离子,并对去簇电压和碰撞能量进行优化。优化后的参数如表1所示。

2.2   色谱条件的优化

2.2.1   色谱柱

选用常规C₁₈色谱柱分离目标组分,试验比较了ZORBAX Eclipse Plus C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.8 μm）和Proshell 120 EC-C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm,2.7 μm）对6种待测组分的分离效果。结果显示,ZORBAX Eclipse Plus C₁₈色谱柱所得6种待测组分的分离度和信号响应更优,因此试验选择采用ZORBAX Eclipse Plus C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.8 μm）分离6种待测组分。

2.2.2   流动相

甲醇-水和乙腈-水体系是液相色谱-质谱分析中常用的流动相。在水中适当加入甲酸或乙酸铵,可使待测组分较好地离子化,从而增强色谱峰响应强度和改善色谱峰峰形。试验考察了乙腈-水、乙腈-含5 mmoL·L⁻¹乙酸铵的0.1%甲酸溶液、甲醇-水、甲醇-含5 mmoL·L⁻¹乙酸铵的0.1%甲酸溶液等体系对6种待测组分的分离效果。结果显示：以乙腈-水体系为流动相时,不管是否添加甲酸和乙酸铵,待测组分的分离度和响应强度均不理想；以甲醇-含5 mmoL·L⁻¹乙酸铵的0.1%甲酸溶液体系为流动相时,相较甲醇-水体系,6种待测组分的分离度和响应强度均较好,这是由于在水中加入低浓度水平甲酸和乙酸铵,能够有效提升待测组分的响应强度和改善待测组分的分离度,同时能消除麻黄碱和酚酞的拖尾现象。因此,试验选择的流动相为甲醇-含5 mmoL·L⁻¹乙酸铵的0.1%甲酸溶液体系。

在优化的仪器工作条件下,6种组分的总离子流色谱图如图1所示。

图  1  6种组分的总离子流色谱图

Figure  1.  Total ion chromatogram of the 6 components

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2.3   样品前处理条件的优化

2.3.1   提取溶剂

由于6种组分均易溶于极性有机溶剂^[17],试验分别选择两种常用溶剂甲醇和乙腈提取加标空白代餐饼干（加标量0.1 mg·kg⁻¹）中6种待测组分。结果显示,甲醇提取所得6种组分的回收率为86.1%~100%,优于乙腈所得的回收率（84.2%~98.3%）。考虑到甲醇提取率较高且环境污染小,试验选择的提取溶剂为甲醇。

2.3.2   提取方式和提取时间

以2.3.1节加标样品为待测对象,试验比较了分别以涡旋、超声、均质提取等3种常见方式提取1,2,5,10,20 min（不同提取时间编号分别为1^#、2^#、3^#、4^#、5^#）时代表性目标组分西布曲明的回收率,结果见图2。

图  2  不同方式提取不同时间时目标组分的回收率

Figure  2.  Recoveries of the target components extracted by different methods for different time

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由图2可知,在提取时间不小于5 min时,涡旋提取所得回收率较超声提取和均质提取的高。同时,均质提取时间较长时,提取液发热,导致N-单去甲基西布曲明和N,N-双去甲基西布曲明的回收率降低；涡旋提取不仅操作便捷,且6种组分回收率在提取时间不小于5 min时较大（均大于90.0%）且不再变化。因此,试验选择采用涡旋提取方式提取5 min。

2.3.3   净化剂总量

净化过程常用吸附剂有C₁₈、PSA、MgSO₄等。其中：C₁₈能较好地吸附非极性杂质和色素等；PSA能较好地除去提取液中糖类、脂肪酸、酚类等酸性成分以及极性色素；MgSO₄是常用的除水剂。由于代餐食品基质较为简单,在提取后可选取现成的分散固相萃取净化管净化。以2.3.1节加标样品为待测对象,比较了C₁₈、PSA和MgSO₄的质量比均为1∶1∶6时3种净化剂总量分别为0,200,400,600,800,1 200,1 600,2 000 mg时6种待测组分的回收率,结果如图3所示。

图  3  不同吸附剂总量下6种组分的回收率

Figure  3.  Recoveries of the 6 components with different total amounts of adsorbents

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由图3可知：未使用吸附剂时,提取液中油性杂质较多,对待测组分干扰较大,西布曲明和芬氟拉明的回收率较低；加入吸附剂后,随着吸附剂用量的增加,待测组分的回收效果逐渐变差,这是由于吸附剂可以一定程度上去除样品中的干扰基质,但是总量过多时,PSA会与羟基、氨基和巯基官能团形成氢键,导致含有这些官能团的待测组分被吸附。因此,试验选择的吸附剂总量为200 mg。

2.4   基质效应

基质效应(ME)是指分析过程中待测组分的响应会因基质的影响而增强或抑制,可采用阴性样品溶液和溶剂制作的标准曲线斜率的比值（ME值）来评估。如果ME值在0.80~1.20内,说明基质对待测组分表现出了轻微的减弱或增强效应,基质效应可忽略,直接采用溶剂配制混合标准溶液系列即可；如果ME值大于1.20或小于0.80,说明基质对待测组分表现出了增强或抑制效应,基质效应不能忽略,需要采用阴性样品溶液配制混合标准溶液系列。

分别以阴性代餐饼干、代餐粥、代餐奶昔溶液和甲醇配制混合标准溶液系列,按照仪器工作条件测定并制作标准曲线。结果显示,6种待测组分的ME值均在0.91~0.98内,说明基质效应较弱,本方法可直接采用溶剂制作标准曲线。

2.5   标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以各待测组分的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标进行线性回归。结果显示,6种待测组分的质量浓度在0.5~20.0 μg·L⁻¹内和峰面积呈线性关系,其他线性参数见表2。

表  2  线性参数、检出限和测定下限

Table  2.  Linearity parameters, detection limits and lower limits of determination

化合物	线性回归方程	相关系数	检出限w/(μg·kg−1)	测定下限w/(μg·kg−1)
西布曲明	y=6.711×104x+1.417×104	0.998 7	3.3	10
N-单去甲基西布曲明	y=7.920×104x+1.865×104	0.999 1	1.7	5.0
N,N-双去甲基西布曲明	y=4.933×104x+1.348×104	0.999 4	3.3	10
麻黄碱	y=1.372×105x+3.457×104	0.999 3	1.7	5.0
芬氟拉明	y=1.323×105x+3.021×104	0.998 6	1.7	5.0
酚酞	y=1.309×104x+4.141×104	0.999 2	1.7	5.0

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以3,10倍信噪比（S/N）对应的质量分数为检出限（3S/N）和测定下限（10S/N）,结果如表2所示。

2.6   精密度和回收试验

按照试验方法对阴性代餐饼干样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD）,结果见表3。

化合物	加标量5.0 μg·kg−1		加标量10.0 μg·kg−1		加标量50.0 μg·kg−1
	回收率/%	RSD/%	回收率/%	RSD/%	回收率/%	RSD/%
西布曲明	88.9	0.86	86.6	0.84	92.9	0.80
N-单去甲基西布曲明	93.7	3.3	91.1	0.31	88.5	1.7
N,N-双去甲基西布曲明	92.3	1.7	94.0	0.82	93.5	2.5
麻黄碱	88.7	2.0	92.4	1.2	79.5	0.65
芬氟拉明	99.4	2.7	102	1.3	95.8	0.39
酚酞	96.1	3.6	92.7	2.8	93.7	4.4

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由表3可知,6种待测组分的回收率为79.5%~102%,测定值的RSD均小于5.0%,满足样品的定量分析要求。

2.7   样品分析

按照试验方法分析线上和线下购买的40批代餐食品,结果显示,3批代餐奶昔样品（标记为阳性样品1^#、2^#、3^#）检出了非法添加药物西布曲明,检出量分别为2.60×10⁷,2.62×10⁷,1.86×10⁷ μg·kg⁻¹,检出情况与其他相关报道^[18-21]一致。食用西布曲明后极可能出现急性症状,建议消费者尽量通过正规渠道购买合格的代餐产品。其中,阳性样品1^#的色谱图和EPI质谱图如图4所示。

图  4  阳性样品的色谱图和EPI质谱图

Figure  4.  Chromatogram and EPI mass spectrum of the positive sample

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本工作采用高效液相色谱-三重四极杆复合线性离子阱质谱法测定代餐食品中6种非法添加减肥药物的含量,可以在5.0 min内完成检测,且预处理简便,回收率和精密度好,可为检测机构定性定量分析代餐食品提供技术支撑。