Indirect Determination of Glucose Oxidase Activity of Food Additives by Ultraviolet-Visible Absorption Spectrometry Based on Hydrogen Peroxide-Potassium Iodide System
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葡萄糖氧化酶(GOD)可催化葡萄糖与氧气反应生成过氧化氢[1],临床上可作为诊断酶用来制备尿糖和血糖试纸,制药工业中可用作维生素C及B12制剂的稳定剂,食品行业中可作为溴酸钾的替代品广泛用于面粉加工[2]。GOD活性体现着酶催化反应速率,常用酶活量U(μmol·min−1,每分钟从葡萄糖溶液体系中释放出过氧化氢的微摩尔数)表示,已报道的测定方法有电化学法[3]、测压法[4]和滴定法[5]。电化学法和测压法对仪器要求较高,随着检测手段的发展已经少有人使用;滴定法具有简便易行、测试成本较低的优势,但其测量精度有限,不便于标准化开发。分光光度法的报道最多,包括连续光度法[6-7]、褪色光度法[8],其中以4-氨基安替比林作供体的连续光度法(双酶法)应用最为广泛,但这种方法对显色反应速率要求比较高,测定过程中不得不使用价格更昂贵的辣根过氧化物酶作显色反应的催化剂,而辣根过氧化物酶不稳定,测量不确定性增加。褪色光度法以传统染料靛蓝胭脂红作氢供体,测定过程中不需使用催化剂,方法简单,试验成本较低,但是体系反应温度为100 ℃,靛蓝胭脂红褪色程度、体系稳定性、过氧化氢反应完全程度很难保障,不适合分析低活性酶。
文献[9]依托碘-淀粉显色反应完成GOD活性测定,有效测定范围为0.1~0.5 U·mL−1,相对标准偏差(RSD)小于5.0%,具有较好的实用性。本研究团队发现,过氧化氢-碘化钾显色体系具有更好的检测性能:反应产物碘在紫外波长288 nm处有强吸收;该体系表观摩尔吸光系数是碘-淀粉显色体系的1.58倍,达到3.57×104 L·mol−1·cm−1。基于此,本工作建立了一种测定GOD活性的简易方法,该方法具有以下优点:有效吸光度上限可扩展到1.5附近;光稳定性良好;测定过程更为简单;方法灵敏度更高。
1. 试验部分
1.1 仪器与试剂
UH5300型紫外-可见分光光度计。
GOD工作液:5 mg·L−1,称取GOD标准品(10 000 U·g−1) 0.5 mg,用100 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)溶解并稀释而成。
葡萄糖-磷酸盐缓冲液:称取一水合葡萄糖1.980 0 g,用100 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)溶解并稀释,配制成葡萄糖的浓度为0.1 mol·L−1的葡萄糖-磷酸盐缓冲液,于−4 ℃冷藏保存,保存期限2 d。
过氧化氢标准溶液(1.0 mmol·L−1)、碘化钾溶液(0.05 mol·L−1)、硫酸溶液(3.0 mol·L−1)和磷酸盐缓冲液(0.05 mol·L−1,pH 7.0)均由相关试剂用水溶解并稀释而成。
除特别说明外,试验所用试剂均为分析纯;试验用水为蒸馏水。试验样品为3种固体酶粉(食品添加剂),酶活力标示值为2 000 U·g−1。
1.2 试验方法
准确称取固体酶粉0.20~0.25 g(精确至0.000 1 g),加入100 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0),磁力搅拌30 min。以转速500 r·min−1离心10 min,吸取0.50 mL上清液,用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)稀释100倍,得到样品溶液。
取葡萄糖-磷酸盐缓冲液1.00 mL,于37 ℃预热5 min,与同步预热过的0.50 mL样品溶液或0.50 mL GOD工作液混合,于37 ℃振荡反应10 min,加入硫酸溶液0.50 mL终止酶反应。再加入碘化钾溶液1.00 mL,于40 ℃反应15 min,用水定容至10 mL。以水作参比,1 cm石英比色皿作吸收池,在288 nm波长处测量体系的吸光度A(扣除了酶空白的吸光度),采用公式(1)计算GOD活性(酶活性用X表示,单位U·mL−1)。
(1) 式中:k为标准曲线的斜率;t为酶催化反应时间,10 min;V为GOD工作液/样品溶液体积,0.50 mL;10为定容体积,mL。
2. 结果与讨论
2.1 可行性分析
分别对含有葡萄糖、碘化钾、0.01 mmol·L−1过氧化氢、0.01 mmol·L−1过氧化氢+碘化钾和0.05 mmol·L−1过氧化氢+碘化钾的5种磷酸盐缓冲液进行紫外-可见光扫描,各体系的紫外-可见吸收光谱见图1,分别对应曲线a~e。
结果显示:葡萄糖、碘化钾和过氧化氢在200~600 nm内无特征吸收峰(曲线a~c);加入过氧化氢和碘化钾后,体系在紫外光区(200~400 nm)出现了碘的特有吸收峰(曲线d~e),吸收峰分别位于288,352 nm处,峰距为64 nm,且吸光度随过氧化氢浓度的增大而升高。以上结果表明,基于过氧化氢-碘化钾体系的紫外-可见吸收光谱法可用于GOD含量的间接测定。
2.2 过氧化氢-碘化钾体系反应条件的优化
直接取1.0 mmol·L−1过氧化氢标准溶液0.50 mL代替酶反应液,后续步骤同1.2节,采用单因素法考察了硫酸溶液用量、碘化钾溶液浓度、反应温度、反应时间对体系吸光度的影响。过氧化氢与碘化钾的反应需在酸性条件下进行,而磷酸盐缓冲液呈中性。为调节体系酸度,试验选用硫酸溶液进行酸化,结果显示,随着硫酸溶液用量的增加,体系吸光度呈现上升趋势,当硫酸溶液用量不小于0.50 mL时,吸光度趋于稳定,因此试验选择的硫酸溶液用量为0.50 mL,详见图2(a)。碘化钾溶液既是还原剂,又是助溶剂,氧化产物碘会和I−结合形成可溶性碘(I3−),从而提高体系的稳定性,当碘化钾溶液的浓度不小于0.05 mol·L−1时,吸光度较大且保持不变,因此试验选择将碘化钾溶液的浓度设定为0.05 mol·L−1。常温下过氧化氢和碘化钾的反应较为缓慢,而温度过高会导致部分碘挥发,适宜反应温度为30~40 ℃,因此试验选择将反应温度控制为40 ℃。体系吸光度随反应时间变化的曲线见图2(b),结果显示,当反应时间不小于10 min时体系吸光度趋于稳定,为保证反应完全,试验选择的反应时间为15 min。
2.3 酶催化反应条件的优化
2.3.1 底物溶液用量
在葡萄糖-磷酸盐缓冲液(底物溶液)中加入GOD工作液0.50 mL,考察了底物溶液用量对体系吸光度的影响。结果显示,体系吸光度随底物溶液用量的增加而显著升高,当底物溶液用量不小于0.40 mL时,吸光度较高并趋于稳定。鉴于GOD催化反应为准一级反应,其反应速率与底物溶液浓度无关;为保证酶催化反应正常进行,体系中葡萄糖浓度需保持绝对过量,因此试验选择的底物溶液用量为1.00 mL。
2.3.2 酶催化反应时间
取 GOD工作液0.50 mL,按照试验方法测量了不同酶催化反应时间下的吸光度A。结果显示:酶催化反应时间为0时,吸光度为0.17,说明碘化钾已被部分氧化;酶催化反应时间继续延长,吸光度快速增大,25 min内随酶催化反应时间t(min)的延长呈线性升高,线性回归方程为A=0.072 5t+0.172 5,相关系数为0.997 7。为缩短测定时间,试验选择的酶催化反应时间为10 min。
2.3.3 酶催化反应终止剂
试验比较了3种常用终止剂硫酸溶液、盐酸溶液和氢氧化钠溶液对酶催化反应的终止效果。结果显示,3种终止剂均可瞬间终止酶催化反应,但碱性介质不利于后续氧化产物碘的稳定存在,盐酸溶液受热易挥发,因此试验选择硫酸溶液作终止剂,并考察了其用量(0,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60,0.80,1.00 mL)对体系吸光度的影响,结果见图3。
结果显示,当硫酸溶液用量为0.40 mL时,吸光度趋于0,酶活性完全消失。结合2.2节中过氧化氢与碘化钾反应对酸度的要求,试验选择的硫酸溶液用量为0.50 mL。
2.4 标准曲线和检出限
在磷酸盐缓冲液1.00 mL中各加入1.0 mmol·L−1过氧化氢标准溶液0,0.05,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50 mL,按照试验方法测定,考察了体系中过氧化氢浓度分别为0,0.005,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 mmol·L−1时吸光度的变化,结果见图4。
结果显示,随着过氧化氢浓度的增加,288,352 nm处的吸光度均随之增加,且吸收峰位置未发生改变。以过氧化氢的浓度(c,mmol·L−1)为横坐标,对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,288,352 nm处的线性回归方程分别为A=35.69c+0.047 14和A=23.63c+0.028 05,线性范围均为0.005~0.05 mmol·L−1,相关系数分别为0.995 5和0.996 0,表观摩尔吸光系数分别为3.57×104,2.36×104 L·mol−1·cm−1。考虑到288 nm处标准曲线的斜率和表观摩尔吸光系数更大,因此试验选择的测定波长为288 nm。
按照试验方法对不含葡萄糖的体系连续测定10次,计算288 nm处体系吸光度的标准偏差s,以3s和288 nm处标准曲线斜率k的比值计算检出限(3s/k),结果为8.4×10−4 mmol·L−1。
酶活性体现的是过氧化氢的生成速率,而不是生成量,当酶催化反应时间为10 min,GOD工作液用量为0.50 mL时,GOD活性测定范围为0.01~0.1 U·mL−1,检出限为1.68×10−3 U·mL−1。
2.5 共存物质干扰试验
当GOD工作液用量为0.50 mL时,按照试验方法考察了0.01 mol·L−1 常见共存物质Fe3+、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+、果糖、蔗糖、维生素 C、麦芽糖对GOD活性测定的干扰情况。结果显示:加入0.01 mol·L−1 Fe3+后,测定值相对误差的绝对值大于5.0%,实际测试时需要排除其干扰;加入其余共存物质后,测定值相对误差的绝对值均小于5.0%,不影响GOD活性测定。
2.6 精密度和准确度试验
取GOD工作液0.50 mL,按照试验方法平行测定6次,计算测定值的RSD。结果显示,GOD酶活性测定值为0.041 2 U·mL−1,RSD为0.85%,表明本方法具有较好的精密度。根据稀释倍数计算得GOD酶活力为8 240 U·g−1,与认定值10 000 U·g−1基本一致。
按照试验方法和文献[5]中双酶法分析3种固体酶粉样品(编号分别为S1~S3),结果见表1。
样品编号 称样量m/g 酶活性理论值/(U·mL−1) 酶活性测定值/(U·mL−1) RSD/% 本方法 双酶法 本方法 双酶法 S1 0.208 8 0.041 8 0.037 5 0.035 9 1.8 3.1 S2 0.236 4 0.047 2 0.042 5 0.042 0 2.3 2.8 S3 0.246 8 0.049 3 0.039 5 0.037 9 1.2 3.5 结果显示:两种方法酶活性测定值远小于理论值,可能原因为GOD酶活性在运输、保存过程中下降;本方法所得的测定值较双酶法的偏高,说明酶催化反应更加完全;相较双酶法,本方法所得测定值的RSD更低,说明本方法具有较高的精密度。
本工作以葡萄糖为底物,利用GOD催化生成中间产物过氧化氢,过氧化氢和碘化钾反应生成显色产物碘,利用紫外-可见吸收光谱法测定,进而计算GOD活性。本方法操作简便,检出限满足食品添加剂GOD活性分析要求,有望为GOD试剂盒开发以及行业标准制定提供技术参考。
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样品编号 称样量m/g 酶活性理论值/(U·mL−1) 酶活性测定值/(U·mL−1) RSD/% 本方法 双酶法 本方法 双酶法 S1 0.208 8 0.041 8 0.037 5 0.035 9 1.8 3.1 S2 0.236 4 0.047 2 0.042 5 0.042 0 2.3 2.8 S3 0.246 8 0.049 3 0.039 5 0.037 9 1.2 3.5 -
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